Mi lehet a probléma, ha a sávok nem jelennek meg a Western Blot-ban?

Válasz:

Sok…

Magyarázat:

Sok oka van annak, hogy a sávok nem jelennek meg egy nyugati bloton. A minta- és antitestkombinációk a múltban működtek-e?

Az alábbiakban csak néhányat találok, amiről arra gondolok, hogy a sávok nem jelennek meg:

1. A fehérje átvitt a gélből? Próbáld meg a membránt festeni valami hasonló ponceau S vagy amido black-val, hogy lássuk, hogy vannak-e a sávok. Néha a membránon lévő fehérje-sávokat úgy láthatja, hogy nedvesíti, és szögben tartja a fényt.

2. Az elsődleges antitest működik? Ez egy kemény tesztelés, és az egyetlen módja annak, hogy pozitív kontrollt adjunk hozzá, ahol tudod, hogy van az érdeklődésre számot tartó fehérje. Ha van néhány érdekes fehérje, megpróbálhatod a Western blotting membránra (azaz nem futtatod a gélt), és látod, ha kapsz-e eredményt, ha a membránt úgy dolgozzuk fel, mintha egy Western blot lenne.

3. A másodlagos antitest felismeri az elsődleges antitestet? Ismét egy kemény teszt. Az egyetlen tesztről, amit tehetünk, a fenti 2. pontban említett helyszíni teszt.

4. Működik a "detektáló rendszer"? A használt detektálási módszertől függően próbálkozhatunk a másodlagos antitestek néhány részében, hogy lássuk, hogy a detektáló oldat és a másodlagos antitest kiváltó szer / enzim működik-e. Ez azt jelenti, hogy a reakciót csak a másodlagos ellenanyaggal indíthatja el?

Végül ugyanolyan egyszerű lehet, mint az egyik megoldás, amelyet a helytelenül elkészített telek próbája során használnak. Például, ha a sókoncentráció hibás a pufferben, akkor ez az antitestek felszabadulását eredményezheti. Ugyanez történne akkor is, ha a pufferek pH-értéke helytelen.

A nyugati blot legmélyebb oka, hogy nem dolgoztam, amit én személyesen tapasztaltam, amikor megváltoztattuk a tejpor szállítóját, amit a membrán blokkolására használtunk. Az új szállítópor foszfotirozin-foszfatázt tartalmaz, amely eltávolította az összes foszfátcsoportot, amelyet anti-foszfotirozin-antitestünkkel próbáltunk kimutatni.